新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.009

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (16): 2913-2920.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.009

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新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性

胡辉^{1, 2}，张伟才^{1, 2}，黄继锋²，严琼娇³，殷义霞³，李世普³

1 南方医科大学研究生院，广东省广州市 510515
2 解放军广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070
3 武汉理工大学生物材料与工程研究中心，湖北省武汉市 430070

收稿日期:2013-02-19 修回日期:2013-03-23 出版日期:2013-04-16 发布日期:2013-04-16
通讯作者: 黄继锋，博士，主任医师，解放军广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070 huangjifenggk@yahoo.com.cn
作者简介:胡辉★，男，1986年生，江西省景德镇市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事创伤骨科及显微外科修复重建的研究。277931568@qq.com
基金资助:
武汉市科技攻关计划项目(编号：200960323125)，课题名称：可吸收周围神经修复制品的应用研究与临床实验。

Cytocompatibility between novel nerve conduit composite materials and bone marrow mesenchymal stem cells

Hu Hui ^{1, 2} , Zhang Wei-cai ^{1, 2}, Huang Ji-feng ², Yan Qiong-jiao ³, Yin Yi-xia ³, Li Shi-pu³

1 Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
2 Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China
3 Research Center of Biomaterials and Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, Hubei Province, China

Received:2013-02-19 Revised:2013-03-23 Online:2013-04-16 Published:2013-04-16
Contact: Huang Ji-feng, Doctor, Chief physician, Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China huangjifenggk@yahoo.com.cn
About author:Hu Hui★, Studying for master’s degree, Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China 277931568@qq.com
Supported by:
the Tackle Key Program of Wuhan City, No. 200960323125*

摘要/Abstract

摘要：

背景：理想的神经修复材料要有良好的生物相容性、生物可降解性、可塑性以及一定的机械强度。
目的：观察自行研制的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与大鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性。
方法：将从SD大鼠骨髓中分离纯化的第3代骨髓间充质干细胞与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料或浸提液共同培养作为实验组，并以含体积分数10%胎牛血清的培养液培养骨髓间充质干细胞作为对照组。观察细胞在复合材料上的生长、存活及凋亡情况。
结果与结论：MTT检测结果显示，共培养5，7 d，实验组吸光度值高于对照组(P < 0.05)；流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，实验组细胞凋亡率显著低于对照组(P < 0.05)；扫描电镜观察见骨髓间充质干细胞在精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料表面生长良好，胞体发出多个突起，并交织成网状，呈典型的神经元样细胞表现。可见精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性，可作为优良的载体用于构建人工仿生神经。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 周围神经损伤, 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸- L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子, 骨髓间充质干细胞, 细胞凋亡, 人工神经, 神经组织工程, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Ideal nerve repair materials are characterized as good biocompatibility, biodegradability, plasticity, and certain mechanical strength.
OBJECTIVE: To evaluate the cytocompatibility of rat bone marrow mesenchymal stem cells with (glycolic acid-L-lysine-lactic acid)/poly lactic acid/β-tricalcium phosphate/nerve growth factor composites.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells which were isolated from Sprague-Dawley rats were co-cultured with (glycolic acid-L-lysine-lactic acid)/poly lactic acid/β-tricalcium phosphate/nerve growth factor composite materials or their extracts, serving as experimental control. Another bone marrow mesenchymal stem cells cultured in the culture medium containing 10% fetal bovine serum served as controls. Cell growth, survival and apoptosis on the composite materials were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Results from 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that absorbance values in the experimental group were higher than those in the control group after co-culture for days 5 and 7 (P < 0.05). Annexin V-FITC/PI double staining results showed that the apoptosis rate of the experimental group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). Under a scanning electron microscope, bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the surface of (glycolic acid-L-lysine-lactic acid)/poly lactic acid/β-tricalcium phosphate/nerve growth factor composite materials. Many protrusions ran out from the cells, and they were woven into a mesh, which was typical performance of neuron-like cells. These findings indicate that (glycolic acid-L-lysine-lactic acid)/poly lactic acid/β-tricalcium phosphate/nerve growth factor composite materials have good cytocompatibility with bone marrow mesenchymal stem cells, which can be regarded as an excellent carrier for artificial nerve construction.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, peripheral nerve injury, (glycolic acid-L-lysine-lactic acid)/poly lactic acid/beta-tricalcium phosphate/nerve growth factor, bone marrow mesenchymal stem cells, apoptosis, artificial nerve, nerve tissue engineering, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

胡辉，张伟才，黄继锋，严琼娇，殷义霞，李世普. 新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2913-2920.

Hu Hui, Zhang Wei-cai, Huang Ji-feng, Yan Qiong-jiao, Yin Yi-xia, Li Shi-pu. Cytocompatibility between novel nerve conduit composite materials and bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(16): 2913-2920.

图/表（结果） 6

2.1 分离培养的骨髓间充质干细胞形态 原代骨髓间充质干细胞接种后24 h内开始出现贴壁现象，此时细胞大多数为圆形，72 h后贴壁细胞有伪足伸出，大多数细胞呈梭形并伴有两三个突起，细胞核较大，扁圆形，可见一两个核仁。经过3代纯化培养后得到的骨髓间充质干细胞为长梭形，形成多个突起并彼此发生联系，完全融合后排列成漩涡状、网状、辐射状结构，见图1。

2.2 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞形态的影响 骨髓间充质干细胞与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液共培养72 h后，呈典型神经细胞样改变，有两个或多个突起，细胞突起之间相互连接成网状，胞质回缩，胞体呈多角形或不规则形，折光性明显增强，见图2。

2.3 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸- L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞活力的影响见表1。

实验采用MTT法检测实验组和对照组细胞吸光度值，结果发现，在共培养后第5，7天，实验组的吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)。

根据吸光度值描绘的生长曲线发现，随着培养时间的延长，实验组和对照组吸光度值逐渐增大，表明细胞活性逐渐增加，实验组吸光度值明显大于对照组，即实验组细胞活性高于对照组，见图3。表明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞不但无毒性作用，还能增加细胞活性。

2.4 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞凋亡的影响 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，实验组细胞凋亡率为(6.43±3.02)%；对照组细胞凋亡率为(16.36±6.88)%，两组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)；共培养7 d，流式细胞仪检测结果显示，实验组右上象限晚期凋亡细胞数明显较对照组少，而细胞活性明显大于对照组，见图4，5。同样证明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液对骨髓间充质干细胞无毒性作用，能延长细胞存活时间，具有良好的细胞相容性。

2.5 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸- L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料对骨髓间充质干细胞生长的影响 扫描电镜观察见共培养7 d，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料部分降解，其表面细胞数较多，细胞生长状态良好，体积较大，胞体发出多个突起，并且细胞之间相互连接交织成网状，其轴突较长和较粗，呈典型的神经元样细胞表现，见图6，说明其降解产物无细胞毒性，释放的神经生长因子具有促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用，细胞相容性良好。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学对比观察实验。
时间及地点：于2012年7至10月在武汉理工大学生物材料与工程研究中心实验室完成。
材料：
实验动物：健康清洁级4周龄雄性SD大鼠4只，体质量180-200 g，由武汉大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。实验过程中对动物的处置严格遵循中华人民共和国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求[6]。
精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子缓释导管与骨髓间充质干细胞相容性检测所用试剂和仪器：
Experimental reagents and instruments:

实验方法：
精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子浸提液的制备：称取灭菌过的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料100 mg装入15 mL离心管，然后加入 3 mL细胞培养液。将离心管置于37 ℃恒温振荡培养箱(100 r/min)，24 h后取出浸提液，按1∶9稀释比例加入α-MEM培养液内混匀，浸提液制备过程确保无菌。
骨髓间充质干细胞的分离与培养：无菌操作下提取SD大鼠骨髓，收集于无菌离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，重悬，计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1接种于25 mL培养瓶中，加入适量培养液，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱孵育。24 h后换液，去除未贴壁的细胞，每3 d换液1次，至细胞基本铺满瓶底后用2.5 g/L胰酶消化，按1∶2比例传代，进行扩增、纯化培养^[7] 。
MTT法检测骨髓间充质干细胞活性：将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞以5×107 L-1细胞浓度接种于96孔培养板，分实验组、对照组和空白组(只加培养液，不含细胞，用于调零)，实验组加精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合膜浸提液0.2 mL，对照组加含体积分数10%胎牛血清的培养液0.2 mL，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度下孵育。隔天半量换液，连续培养7 d。分别取培养1，3，5，7 d细胞进行MTT法检测^[8-9] ，在酶联免疫检测仪上选择570 nm波长测定吸光度值，记录实验数据。
流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率：将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板，分为实验组和对照组，实验组加精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料浸提液2 mL，对照组加含体积分数10%胎牛血清的培养液2 mL，37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度下孵育。每2 d换液1次，连续培养7 d，分别取各组细胞进行Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率^[10] ，记录实验数据和流式散点图，左上象限(FITC^- /PI⁺)为机械损伤细胞，左下象限(FITC^- /PI^-)为正常活细胞，右上象限(FITC⁺/PI⁺⁾为晚期凋亡或死亡细胞，右下象限(FITC⁺/PI^-)为早期凋亡细胞。细胞凋亡率由仪器自动计算。
扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在材料表面的生长情况：将无菌的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合膜剪成12孔培养板孔洞大小，与细胞浓度为1×10⁹ L^-1骨髓间充质干细胞共同置于12孔培养板中， 37 ℃、体积分数5%CO2及饱和湿度条件下孵育。将培养7 d后的材料取出，PBS冲洗3次，体积分数2.5%戊二醛4 ℃固定1 h。体积分数30%，50%，75%，80%，90%，100%叔丁醇脱水，前4级脱水各1次，每次10 min，后2级脱水各2次，每次10 min。保留样本内叔丁醇-20 ℃冰冻冷藏4 h，干燥2 h；喷金，在扫描电镜下观察材料表面细胞生长状况。
主要观察指标：与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料或浸提液共培养的骨髓间充质干细胞生长情况、细胞活力及细胞凋亡率。
统计学分析：结果用x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤的修复仍是临床面临的巨大挑战。对于长段、粗大的神经缺损，主要采用自体神经移植进行修复以恢复肢体功能^[11] 。但往往会造成供体神经支配区感觉、功能障碍，且自体神经来源有限。组织工程学研究为解决这一问题提供了新思路[12]。组织工程人工神经主要包括神经支架和种子细胞和高分子成分^{[3, 13-14]} ，神经支架最重要和基本的组成是中空的神经导管。

组织工程中应用较多的种子细胞有：许旺细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌干细胞、神经干细胞以及胚胎干细胞等^[15-16] 。研究发现，骨髓间充质干细胞具有诱导分化潜能，且诱导分化后的细胞形态类似许旺细胞，在体外能形成髓鞘磷脂成分并分泌神经营养因子，国内学者用复合诱导因子在体外诱导骨髓间充质干细胞分化，诱导后的细胞形态类似神经细胞，免疫荧光及免疫组化检测分化的细胞神经细胞特异性表面标志物阳性^[17-20] 。Cuevas等^[16]将分离纯化的骨髓间充质干细胞注入 5 mm的坐骨神经缺损处，术后18-180 d分别检测神经功能恢复与细胞表型变化，发现术后18 d神经功能恢复了36%，33 d恢复了78%，180 d恢复了96%，证实了种子细胞修复神经损伤的可能性。

导管材料作为人工细胞外基质为细胞提供赖以黏附、生长、分化和增殖的场所，有利于细胞进行正常新陈代谢^[21]。目前应用于临床的神经导管分为可降解型和非可降解型^[22] ，主要包括：生物型神经导管、人工合成导管、复合组织导管。研究表明^[13] ，神经再生过程中，断端的神经再生和神经营养因子、神经生长因子等的作用关系密切，当神经缺损超过一定距离后，营养物质供应缺乏，导致远端和近端不能重新连接。神经再生需要适宜的微环境，即将有利于神经再生的细胞外基质以各种形式充填于神经导管中，以促进神经再生。黄继锋等^[23-24]用精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子缓释导管修复大鼠10 mm坐骨神经缺损，结果表明该神经导管对大鼠坐骨神经缺损具有良好的桥梁作用并能促进神经生长。

理想的神经修复材料要有良好的生物相容性、可降解性、可塑性以及一定的机械强度^[25-27] 。研究者们希望在神经导管内添加许旺细胞、神经生长因子及内部支架结构组成复合神经导管用于更长段距离的神经缺损^[28] 。课题组从生物仿生角度出发，以神经基底膜的结构与组成分析研究为基础，自行设计合成了精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝的高分子聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)^[5] ，在此基础上添加聚乳酸、β-磷酸三钙和神经生长因子制成了复合材料。该材料的降解产物为氨基酸、乳酸等参与人体正常新陈代谢的物质，动物实验证明没有细胞毒性^[23] ，降解产物中的几种氨基酸是目前应用最广且被证明最有效的促黏附多肽之一，具有较高的细胞亲和性^[14] 。材料中加入β-磷酸三钙，既可以增强材料的强度和韧性，又可以中和聚乳酸降解产生的酸性物质，减轻酸性环境引起的无菌性炎症，符合理想神经导管的要求。

周围神经损伤后的修复需要适合的微环境，而神经生长因子是神经再生微环境中的重要因素之一，对神经的生长和延伸方向起着重要的营养和诱导作用^[29] 。精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料成功的引入了外源性神经生长因子，植入体内后能够缓慢的释放神经生长因子，前期研究表明该材料能在体内持续释放30 d之久，充分保证了局部神经再生所需的浓度值^[30]，这是其他任何神经修复材料所不具备的优势。

实验就精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合神经导管材料与骨髓间充质干细胞相容性进行了初步研究，扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料表面黏附、生长情况良好，胞体发出多个突起，并交织成网状，呈典型的神经元样细胞表现，说明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料无细胞毒性，对骨髓间充质干细胞的生长无不良影响，且可诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化；流式细胞仪检测结果显示，实验组细胞凋亡率明显低于对照组，表明精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料不但对细胞生长没有阻碍，而且还能延缓细胞衰老，增加细胞活性；MTT检测结果显示，实验组吸光度值明显高于对照组，同样能得出上述结论。证实了精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合神经导管与骨髓间充质干细胞具有良好的组织相容性，可作为骨髓间充质干细胞的优良载体，具备研制人工仿生神经的理论基础，为神经修复带来了新的希望。

新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性

Cytocompatibility between novel nerve conduit composite materials and bone marrow mesenchymal stem cells

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